深層組織的高分辨率·高亮度分析

深層組織的高分辨率·高亮度分析

SeeDB2

SeeDB2 Trial Kit是用于SeeDB2法的透明化試劑盒，通過調(diào)整Permeabilization solution、Clearing Solution等各種試劑，可實現(xiàn)透明化。該方法由柯孟岑老師、今井猛博士等人開發(fā)，通過制備試劑盒內(nèi)的溶液并浸泡腦組織塊，即可實現(xiàn)透明化。特別適用于通過熒光蛋白標(biāo)記樣本的3D高分辨率成像。

該方法保留了腦組織的微結(jié)構(gòu)，由于調(diào)節(jié)為高折射率（RI=1.52），適用于高分辨率成像，也可應(yīng)用于迄今為止難以進(jìn)行的樹突棘定量分析。

對照SeeDB2G的甘油折射率（1.46）和SeeDB2S的油折射率（1.52），分別用甘油浸沒鏡頭和油浸鏡頭觀察，可見即使在深層部分也沒有因為球面像差而引起模糊（分辨率降低）。

此外值得注意的是在SeeDB2中，熒光蛋白的熒光保持非常穩(wěn)定，并且優(yōu)于PBS和其他市售的封固劑。因此，SeeDB2十分適合作為熒光蛋白標(biāo)記樣本的封固劑。它不僅可用于厚樣本，還可用于細(xì)胞生物學(xué)的薄樣本和組織切片。

數(shù)據(jù)提供：國立研究開発法人理化學(xué)研究所柯孟岑先生、今井猛先生（現(xiàn)九州大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院）

本試劑盒內(nèi)容：1）皂素、2）SeeDB2G solution、3）SeeDB2S solution、4）PBS

◆SeeDB2特點(diǎn)

● 可在保留微結(jié)構(gòu)的同時完成透明化

● 調(diào)整為高折射率，可觀察深層結(jié)構(gòu)

● 穩(wěn)定維持來自熒光蛋白的熒光^※

※Alexa等染料會出現(xiàn)褪色

經(jīng)實例驗證可透明化處理的樣本

小鼠腦組織塊、蒼蠅全腦、類器官/球狀體

SeeDB2 Trial Kit試劑盒構(gòu)成

1. SeeDB2G Solution 50 mL x 1支

2. SeeDB2S Solution 50 mL x 1支

3. PBS（-）50 mL x 1支

4. Saponin 5 g x 1支

SeeDB2S：與油浸物鏡浸液的折射率（1.52）相匹配，可用作油浸鏡頭觀察時的封片劑。 用于高分辨率成像。

SeeDB2G：與甘油浸物鏡浸液的折射率（1.46）相匹配，可用作甘油浸鏡頭觀察時的封片劑。 用于觀察較大的組織樣本。

透明化所需試劑或器材（具體請參考附件）

試劑

1. SeeDB2 Trial Kit

2. 多聚甲醛（產(chǎn)品編號：160-16061）

3. 1×PBS（產(chǎn)品編號：164-25511）

4. 透鏡浸液

器材

1. huan形鑷子或畫筆

2. 試管旋轉(zhuǎn)器

3.  無菌過濾器

4. 振動切片機(jī)

5. 透明化樣品觀察容器（透明室）

6. 玻璃載玻片和蓋玻片（如使用透明室則不需要）

7.  用于SeeDB2透明化樣本的熒光顯微鏡^※和推薦物鏡^※※

※ 共焦顯微鏡、雙光子顯微鏡、超分辨率顯微鏡

※※ 請使用與折射率（RI=1.46或1.52）相匹配的物鏡。 建議在獲取數(shù)據(jù)前向顯微鏡制造商咨詢。

◆Protocol示例

小鼠腦0.5-2mm切片

● Permeabilization Solution：含2% saponin的PBS溶液

● Clearing Solution 1：含20％ saponin的水溶液和SeeDB2G以2:1比例混合的溶液

● Clearing Solution 2：含20% saponin的水溶液和SeeDB2G以1:1比例混合的溶液

● Clearing Solution３：含2% saponin的SeeDB2G

● Clearing Solution 4：含2% saponin的SeeDB2S

圖1. 小鼠腦SeeDB透明化案例

小鼠腦切片（1.5mm厚）的SeeDB2處理前后

◆應(yīng)用示例

● 共聚焦顯微鏡觀察實例

● 超分辨率顯微鏡觀察實例

● 神經(jīng)細(xì)胞的多色熒光成像

使用共聚焦顯微鏡觀察小鼠腦切片的實例

圖2. 使用共聚焦顯微鏡觀察Thy1-YFP H系小鼠腦切片

使用NA 1.4油浸物鏡。即使不調(diào)整激光功率，從上到下得到的亮度也幾乎恒定。比例尺為2 µm

超分辨率顯微鏡觀察實例

在超分辨顯微鏡下觀察使用 SeeDB2S/Super Clear Mount（產(chǎn)品編號：190-18661）進(jìn)行了透明化和封片處理的樣品（圖3、4）

圖3. 絲狀偽足在細(xì)胞膜上的生長

使用核染色試劑和線粒體染色試劑對在細(xì)胞膜上表達(dá)EGFP的HEK293T細(xì)胞進(jìn)行染色和觀察。 通過超分辨率數(shù)據(jù)可觀察到絲狀偽足在細(xì)胞膜上的生長（圖3）。

圖4. 果蠅大腦深部的超分辨率成像（深度約100 μm）

使用GFP標(biāo)記Mi1（果蠅腦髓質(zhì)神經(jīng)節(jié)中的一個神經(jīng)細(xì)胞）并進(jìn)行超分辨率觀察（圖4）。

神經(jīng)細(xì)胞的多色熒光成像

圖5. 使用Tetbow法進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞的多色熒光成像

使用Tetbow法^※ 標(biāo)記小鼠嗅球二尖瓣細(xì)胞和簇狀細(xì)胞的數(shù)據(jù)。比例尺為20 μm。

※ Tetbow法：使用不同顏色對單個神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行高亮度染色。

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